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技術文章

細胞因子生物學活性檢測和濃度測定的分析方法點擊次數:1449 更新時間:2021-07-23

  細胞因子已廣泛應用于臨床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及試用于臨床的白細胞介素等。為了研究細胞因子在生理系統的作用以及了解細胞因子產品用于臨床治療的效果,進行細胞因子的檢測就很重要,而且用于臨床診斷的細胞因子分析方法必須適用于常規操作。
 
  細胞因子生物學活性檢測和濃度測定的分析方法主要有以下幾類:
 
  1.1 生物分析法
 
  生物分析法方便,敏感性高,但所有細胞系有可能受幾種細胞因子的影響,特異性則較差。又由于可溶性細胞因子受體等抑制劑的存在,使生物分析法可能低估細胞因子的活性。常用的方法有2種:(1)依賴性細胞株增敏實驗。一些腫瘤細胞株依賴于細胞因子方能在體外增殖,如TF-1細胞株依賴于GM-CSF和IL-3[4,5] ,CTLL細胞株依賴于IL-2,TTD-1細胞株依賴于IL-6等 [4] 。可利用這些依賴株檢測相應的細胞因子。但是,并非所有細胞因子均有相應的依賴株,因此限制了此法的應用。(2)功能檢測實驗。利用一些細胞因子的功能特性而建立相應的活性測定方法。如IFN抗病毒實驗和tnf對L 929 細胞的殺傷作用等[4] 。此外,生物分析法還有骨髓集落形成實驗,細胞毒或細胞抑制實驗,次級分子分泌的誘導,化學趨化和細胞因子分泌性的抑制實驗等。
 
  1.2 免疫分析法
 
  利用抗原機體反應的原理,制備出抗細胞因子的單抗或多抗,可進行細胞因子的免疫檢測,它包括放免實驗(RIA)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)等。其優點是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點是不能證明被測細胞因子是否為具有完整生物活性結構的蛋白質而非變性蛋白質。
 
  1.3 CKmRNA的測定
 
  (1)分子雜交實驗:首先制備出細胞因子的基因探針,通過分子雜交檢測細胞內CKmRNA的表達。(2)逆轉錄PCR(RT-PCR)法技術:可快速、靈敏地檢測表達很低的CKmRNA,并可同時測定同一樣本中多種CKmRNA,操作過程包括細胞因子產生細胞的RNA提取,mRNA經逆轉錄合成cDNA,以cDNA為模板,在細胞因子引物的引導下,即可進行PCR擴增。根據定量CKmRNA方法和原理的不同,可分為半定量PCR法,競爭性定量PCR法,內參標定量PCR法,HPLC-PCR法和酶聯免疫定量PCR法 [6] 。目前市售的商品試劑盒已能用于大多數細胞因子的檢測,但因其價格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時,人細胞因子的測定仍存在許多問題,檢測方法選擇不當可能得到不一致的結果,有時有必要選擇一個以上的檢測方法測定細胞因子。
 
  2.靈敏度
 
  細胞因子具有很強的生物學活性,其生物分析法的靈敏度高。然而,在測定血漿中細胞因子正常濃度時,難以確定免疫分析法令人滿意的靈敏度。不同細胞因子的參考值變化很大,難以定義其參考值范圍。如Damas等在研究細胞因子與敗血癥時,使用兩步免疫放射測定實驗(IRˉMA)測定IL-6(靈敏度:5ng/ml)一步IRMA法測定TNF-α(靈敏度:5ng/L)和IL-1β(靈敏度:4ng/L),在正常血清中未測得上述細胞因子。而Riikonen等使用具有相似檢測限的RIA法,在20例健康兒童中,IL-1β的平均濃度為12.1ng/L,IL-6的平均濃度為83ng/L;在71例健康兒童中,TNF-α的平均濃度為40±2ng/L。由此可見,不同的免疫分析方法之間存在較大的差異,其靈敏度變化可能是由于其準確度和特異性的不同而引起。
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